Kromatografi; çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket etmeleri esasına dayanır. HPLC; bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler ilk olarak çözgende çözünürleştirilirler ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki faz arasında dağılırlar. Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz (stasyoner faz) denir.
• Pompa: Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını sağlamaktır. Dakikada akan mL cinsinden gösterilir.
• Enjektör: Genellikle enjekte edilen numune hacimleri 0.1- 20-mikrolitre (µL) arasındadır. Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı olmalıdır. Oto örnekleyiciler analizcilerin zaman kaybını en aza indirecek şekilde tasarlanmaktadır.
• Kolon: 5 – 100 °C arasında ayarlanabilmektedir, Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir. Ayırma kolonda gerçekleşir. Durgun faz mm boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır. Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre gerçekleşir. Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir.
• Dedektör: Kolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi ve ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi sağlar. Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar buna da kromatogram denir . En çok kullanılan dedektörler;
- Spektroskopik
- Floresans
- Kırılma indisidir.
• Kaydedici
Çalışma Prensibi
1.adım: Numunenin uygun çözücüde çözünmesi
2.adım: Ayrım, Bileşenlerin ayrımı kolonda gerçekleşir, Kolon, çelik bir borudan oluşan içi silika jel ile doldurulmuş bir yapıdan oluşur. Çözünen karışım kolona enjekte edilir. Kolon boyunca sıvının hareket etmesi için bir basınç uygulanır, bu sıvı karışımına hareketli faz denir.
3.adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi, konsantrasyonu bilinmeyen bir örneğin solüsyonda tayin edilmesi; genelde örneğin standart çözeltisinin bilinen farklı miktarlarının kolona verilmesi ve elde edilen değerlerin korelasyonunun yapılması ile mümkün olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanları veya pik yüksekliklerinin kullanılması ile yapılır.
HPLC ile Yapılabilen Analizler
